【摘要】 豐富的神經(jīng)示蹤技術(shù)極大的促進了神經(jīng)解剖學(xué)的發(fā)展，為神經(jīng)生物學(xué)的各種研究提供了良好基礎(chǔ)，在此，我們概述了常用神經(jīng)示蹤劑及其示蹤特點，重點介紹了各種熒光染料和植物凝集素IB4的示蹤特點。

【關(guān)鍵詞】 神經(jīng)示蹤劑;辣根過氧化物酶;熒光染料;植物凝集素IB4;病毒

Common characteristics of the neural tracers

　　Zhu He1,2, Li Li2, Zhao Lei2, Ma Ketao2, Si Junqiang2

　　（Shihezhi University, Shihezhi Xinjiang 832002）

自20世紀70年代初Kristenson將辣根過氧化物酶（HRP）應(yīng)用于追蹤神經(jīng)纖維以來，該方面的研究取得了的迅猛發(fā)展。此后，許多用途廣泛、敏感性強并能選擇性地進行順行、逆行標記或同時具有順、逆行標記的追蹤物質(zhì)被應(yīng)用到神經(jīng)纖維的研究，對神經(jīng)解剖學(xué)的發(fā)展起到了積極的推動作用?，F(xiàn)就常用的神經(jīng)示蹤劑及其示蹤特點綜述如下：

　　1辣根過氧化物酶

　　1.1辣根過氧化物酶（Horseradish peroxidase，HRP） HRP是一種含血紅素基的植物糖蛋白。HRP法是20世紀70年代發(fā)展并被廣泛應(yīng)用的一種神經(jīng)追蹤方法，但由于HRP顯影需要許多復(fù)雜的免疫組織化學(xué)技術(shù)，而且HRP參與細胞代謝，不能在細胞內(nèi)長期存留，易擴散到鄰近組織造成神經(jīng)元的誤染，其反應(yīng)產(chǎn)物較不穩(wěn)定，易丟失，另外還存在“再攝取”現(xiàn)象[1]， 使得HRP在神經(jīng)逆行示蹤方面的應(yīng)用大大減少。

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　　1.2 霍亂毒素亞單位B結(jié)合的辣根過氧化物酶（CBHRP）R. N.Ranson等[2] 對傳統(tǒng)的辣根過氧化物酶的染色方法進行了改進，采用結(jié)合了霍亂毒素亞單位B的辣根過氧化物酶（CBHRP）作為示蹤劑，清晰顯示了神經(jīng)元的胞體和軸突結(jié)構(gòu)。近來也有采用四甲基聯(lián)苯胺（TMB）為底物替代傳統(tǒng)的二氨基聯(lián)苯胺（DAB）來示蹤豚鼠的面神經(jīng)[3]的報道。TMB與DAB相比有不致癌和HRP反應(yīng)靈敏度高，操作簡便，步驟少，用時短及成本低等諸多優(yōu)點。

　　HRP法標記的神經(jīng)元經(jīng)組織化學(xué)法處理后,細胞失去了活性,無法進行膜片箝等神經(jīng)電生理的研究,限制了HRP法在這一領(lǐng)域內(nèi)的應(yīng)用。

　　2熒光染料

　　從上世紀50年代開始，熒光染料示蹤技術(shù)發(fā)展起來。它貯存穩(wěn)定，特別是組合采用不同的熒光染料分別標記神經(jīng)元胞核和胞漿，可實現(xiàn)熒光雙標或多重標記，這是熒光素示蹤的一個zui大優(yōu)點。這種示蹤劑染色后只需使用熒光顯微鏡，便可觀察到已被標記的神經(jīng)纖維或胞體。下面介紹幾種常用的熒光素。

　　2.1 固藍（Fast blue，F(xiàn)B）FB系水溶性染料，其顆粒較細密，易于被神經(jīng)軸索攝取，所以標記神經(jīng)纖維或胞體多于其他染料，易于從標記細胞內(nèi)擴散到周圍組織，照射時褪色較快，即使保存在低溫、避光條件下，仍不能長期保存。對需要標記后較長時間的觀察，或需分離培養(yǎng)神經(jīng)元細胞進行實驗研究則不太理想。

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　　2.2 熒光金（Fluoro gold，F(xiàn)G）FG系脂溶性染料，能標記細胞質(zhì)，它在紫外線（323nm）激發(fā)下發(fā)金黃色光（408nm），屬慢速軸漿運輸類，細胞核不著色，能很好顯示樹突分支，細胞外無熒光染料滲漏，不易擴散，與周圍組織分界清晰，褪色比較慢，可以經(jīng)受許多組織學(xué)染色處理，因而可以和HRP、免疫組織化學(xué)等方法結(jié)合。其在細胞質(zhì)內(nèi)的存在不超過3周[4]。

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　　有學(xué)者將其用于視神經(jīng)的研究,標記了視神經(jīng)纖維的分布路徑和走向[5]。Takayuki Nakajima等[6]采用熒光金結(jié)合SP、CGRP免疫熒光標記反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)大鼠L6DRG和S1DRG內(nèi)均存在大小不等的SP/CGRP雙標記神經(jīng)元及中小型大小的FG/SP、FG/CGRP雙標記陽性細胞和FG/SP/CGRP三標記陽性細胞，這些標記陽性細胞可能與包皮系帶損傷后陰莖自發(fā)性疼痛的產(chǎn)生和傳遞有關(guān)。

　　2.3 羰化青（1,1′ Dioctadecyl3,3,3′,3′ tetramethylindocarbocyanine perchlorate，DiI） DiI是一種紫紅色晶體，具有高度的親脂性,在水中的溶解度很低，通常用乙醇溶解。它熒光強而穩(wěn)定,無毒性，不影響被標記細胞的存活、生長，在標記細胞內(nèi)消失慢、單純沿脂質(zhì)膜擴散，有良好的軸突特異性，且對過路纖維影響小。在549nm激發(fā)光下可以產(chǎn)生發(fā)射波長為565 nm紅色熒光[7]。

　　1986年Honig[8]等報道DiI可作為熒光示蹤劑用于培養(yǎng)的神經(jīng)細胞和骨骼肌細胞。DiI對試管內(nèi)動物胚胎的感覺和運動神經(jīng)元沒有顯著的毒性作用，因而適用于活的組織、細胞的示蹤、標記。但也有研究報道顯示DiI易于淬滅及易向神經(jīng)元胞體外擴散的問題[9]?？偟膩碚f, DiI具有在細胞內(nèi)穩(wěn)定表達、標記細胞形態(tài)良好、對活體細胞無毒性、在標記細胞內(nèi)消失慢[10]、使用簡便、染色速度快的特點。尤其是不影響被標記細胞的電生理和生化特性使其越來越多的被用于神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的研究[11]。

　　2.4 熒光染料雙標染色法 雙標技術(shù)是通過不同示蹤劑對細胞核、細胞漿親和力不同，用兩種示蹤劑對不同的神經(jīng)纖維或靶器官進行標識。

　　2.4.1 固藍（Fast Blue） 和核黃（Nclear Yellow） 雙標染色 Viterbo F等[12] 用固藍和核黃雙標染色研究損傷后的脛神經(jīng)和腓神經(jīng)的側(cè)芽來源情況，對神經(jīng)纖維進行了直接的形態(tài)學(xué)觀察。

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　　2.4.2固藍（Fast Blue）和雙脒基黃（Diamidino Yellow） 雙標染色 雙脒基黃（Diamidino Yellow）熒光激發(fā)波長360 nm，經(jīng)神經(jīng)軸漿流的逆行轉(zhuǎn)運可達細胞核，細胞核呈綠色、黃綠色或黃白色。激發(fā)后熒光很強時，細胞漿有時映出部分黃綠色或黃白色。C.T. Byers等[13]比較了固藍（Fast Blue）和雙脒基黃（Diamidino Yellow）逆行標記神經(jīng)元的效力,研究結(jié)果顯示無論是單獨使用還是二者按任何次序聯(lián)合使用,被標記的神經(jīng)元的數(shù)目是一致的。證明使用FB和DY進行熒光雙標的方法是可行的。相對于FB和其他的熒光染料組合形式,DY和FB的組合更為合理。DY能夠標記細胞核的同時FB可以清晰的顯示細胞漿,在同一熒光顯微鏡下,二者可以清晰的顯示被標記的細胞而充分互補。

　　2.4.3 臺盼藍（Trypan Blue） 和雙脒基黃（Diamidino Yellow） 雙標染色 臺盼藍熒光激發(fā)波長為375 nm，經(jīng)神經(jīng)軸漿流的逆行轉(zhuǎn)運可達細胞漿，激發(fā)后細胞漿呈亮藍色。Yang等[14] 使用雙脒基黃和臺盼藍熒光雙標研究切斷腓總神經(jīng)后行腓總神經(jīng)斷端和脛總神經(jīng)吻合的脊髓背根神經(jīng)節(jié)細胞發(fā)現(xiàn),在相應(yīng)L4L6背根神經(jīng)節(jié)及相應(yīng)脊髓腰膨大中分別存在雙脒基黃和臺盼藍雙標的細胞，說明兩神經(jīng)之間有交叉支配的存在，表明神經(jīng)端側(cè)縫合后的再生方式是側(cè)枝芽生。

　　1991年Fritzsch和Sonntag[15]比較研究了熒光素和生物素葡糖聚胺的標記效力，隨后Harsh[16]等在1991年又比較了FG素和DiI兩者之間的標記效能。1993年，Brushart等人又分別比較研究了熒光素和HRP之間的標記效能。這幾種示蹤劑的組合的弊端是在同一顯微鏡下不能被同時觀察到。更重要的是，生物素葡糖聚胺和DiI通常情況下不被未損傷神經(jīng)攝取的特性決定使用兩者作為標記物時必須先切斷或損傷被標記神經(jīng)。常用的幾種熒光染料中，TB和FB能夠標記細胞漿，NY和DY能夠特異的結(jié)合被標記細胞的細胞核。

　由于熒光素分子量小，用于逆行追蹤的共同問題是易于擴散，比HRP法更難于確定有效注射部位。與HRP法相似，熒光素示蹤法也存在過路纖維攝入問題。褪色是熒光素的一大缺點，在激發(fā)光照射下較快褪色，因此允許觀察的時間短。即使在低溫、避光條件下，切片保存時間仍有限，不能長期保存。

　　3 生物素葡糖聚胺（Biotindextran amine, BDA）

　　BDA應(yīng)用于軸漿運輸?shù)母鞣N示蹤劑，常用來研究神經(jīng)元的分支投射，但很少有直接用于觀察周圍神經(jīng)局部軸突的研究。BDA具有保存時間長，并可與多種熒光追蹤劑及各種免疫組織化學(xué)技術(shù)相結(jié)合的優(yōu)點[17]，能滿足光鏡及電鏡下觀察的要求。相對于HRP與熒光素示蹤劑，經(jīng)處理的BDA標記組織標本可以保存6個月以上，不影響zui終顯影結(jié)果。

　　4病毒

　　常用在神經(jīng)通路示蹤方面的兩類病毒是腺病毒（Adenovirus）、腺病毒伴隨病毒（Adenoassociatedvirus,rAAV）和皰疹病毒。

　　腺病毒和腺病毒伴隨病毒在神經(jīng)示蹤中的應(yīng)用得益于綠色熒光蛋白（Greenfluorescenceprotein,GFP）基因的發(fā)現(xiàn)。日本科學(xué)家下村修、美國科學(xué)家馬丁·沙爾菲和美籍華裔科學(xué)家錢永健正是因為在發(fā)現(xiàn)和研究綠色熒光蛋白方面做出的重大貢獻摘取了2008年的諾貝爾化學(xué)獎。

　　GFP來源于維多利亞水母（AequoreaVictoria）,其熒光發(fā)射峰在509nm，zui大激發(fā)波長為395 nm，并在470 nm處有1個肩峰[18]，其化學(xué)性質(zhì)相當(dāng)穩(wěn)定[19]。熒光蛋白的顯著優(yōu)點是與生物相容性好，標記生物分子后不影響其生物活性，發(fā)光強度高，易于識別與檢測。但是，目前熒光蛋白種類還比較少，而且大部分都是從生物體中提取，較難大批量生產(chǎn)[20] 。

　　4.1腺病毒（Adenovirus）、腺病毒伴隨病毒（Adenoassociatedvirus,rAAV）構(gòu)建表達GFP的腺病毒和rAAV載體，用于神經(jīng)細胞和神經(jīng)通路的示蹤，具有*的優(yōu)點。GFP產(chǎn)生的熒光可以耐受光漂白和福爾馬林的固定，能夠制成長期保存的標本[21]，可用于不同神經(jīng)元的形態(tài)學(xué)分析和纖維的研究，尤其適用于某些特定功能的局部神經(jīng)環(huán)路的研究。

　　但是注入GFP 基因重組病毒的多少將影響GFP熒光的強弱。如果注入重組病毒過少時，熒光淺淡而不易觀察，如果注入的GFP基因重組病毒較多，它在標記神經(jīng)元及突起的同時，會增多對神經(jīng)膠質(zhì)細胞的標記，產(chǎn)生干擾[22]。

　　4.2 皰疹病毒（Herper virus）皰疹病毒的主要特點是親神經(jīng)性和跨神經(jīng)元傳遞。皰疹病毒是具有復(fù)制能力的病毒，作為神經(jīng)通路的示蹤劑,它能夠?qū)κ聚櫺盘栠M行放大，增加了示蹤的靈敏度。在應(yīng)用皰疹病毒作為神經(jīng)示蹤劑時，對病毒毒株的選擇對實驗成敗具有重要的意義。

　　5植物凝集素IB4

　　凝集素（Lectins）是一類從各種植物種子和動物組織中提取的糖蛋白或結(jié)合糖的蛋白。凝集素zui大的特點是能識別細胞膜中復(fù)雜的碳水化合物結(jié)構(gòu)，即細胞膜表面的糖基。

　　作為初級傷害性感受器的小直徑感覺神經(jīng)元根據(jù)和IB4結(jié)合能力的不同可以分為植物凝集素陽性的非肽能神經(jīng)元和植物凝集素陰性的肽能神經(jīng)元，前者呈膠質(zhì)源性營養(yǎng)因子依賴性，而后者則呈神經(jīng)生長因子依賴性[23]。植物凝集素陽性的非肽能神經(jīng)元的動作電位相對于植物凝集素陰性的肽能神經(jīng)元而言，其持續(xù)時間較長、具有更高密度的河豚毒素不敏感的鈉電流以及更小的熱傷害刺激電流[24]。Belyantseva等[25]發(fā)現(xiàn)在遭受慢性損傷后，植物凝集素陰性的肽能神經(jīng)元會大量的增生。

　　綜上所述，辣根過氧化物酶zui早應(yīng)用于神經(jīng)的逆行示蹤，但由于使用方法較復(fù)雜且穩(wěn)定性差、易擴散，限制了它的應(yīng)用;熒光示蹤劑使用方法簡便易行、易觀察，但存在熒光淬滅現(xiàn)象，僅適用于短期觀察，而生物素葡聚糖胺則不存在這種現(xiàn)象，其結(jié)果可以保存較長時間;其他毒素或病毒鰲合物能良好地顯示神經(jīng)元鏈或網(wǎng)絡(luò)，但目前在神經(jīng)示蹤方面應(yīng)用較少;物凝集素IB4能特異地和脊神經(jīng)節(jié)內(nèi)與傷害性刺激相關(guān)的小型神經(jīng)元結(jié)合，為脊髓背根神經(jīng)節(jié)痛覺相關(guān)小直徑細胞的研究提供了極大的方便。

【參考文獻】
　　1 Kamijo Y, Koyama J, Oikawa S, et al. Regenerative process of the facial nerve: rate of regeneration of fibers and their bifurcations[J]. Neurosci Res, 2003, 46（2）: 135-143.

　　2 Ranson RN, Motawei K, Pyner S, et al. The paraventricular nucleus of the hypothalamus sends efferents to the spinal cord of the rat that closely appose sympathetic preganglionic neurones projecting to the slate ganglion[J]. Experimental Brain Research, 1998, 120（2）: 164-172.

　　3 Sahni V, Qi Y and Frostick S. Peripheral nerve regeneration[J]. Eur Surg, 2005, 37（4）: 187-192.

　　4 SellesNavarro I, VillggasPerez MP, SalvadorSilva M, et al. Retinal ganglion cell death after different transient periods of pressureinduced ischemia and survival intervals. A quantitative in vivo study[J]. Invest Ophthalmol Vis, 1996, 37（10）: 2002-2014.

　　5 Chen Pei, Wang Peng, Chen Guangli and Gong Shusheng. Study on remodeling of astrocytes in facial neuclus after peripheral injury[J]. Journal of Huazhong University of Science and Technology, 2005, 25（6）: 726-728.

　　6 Takayuki N, Seiji O, Yamamoto S , et al. Differences in innervation and innervated neurons between hip and inguinal skin[J]. Clinical Orthopaedics and Related Research, 2008, 466（10）: 2527-2532.

　　7 Swift MJ, Crago PE, Grill WM. Applied electric fields acceletate the diffusion rate and, increase the diffusion distance of DiI in fixed tissue[J]. Neurosci Methods, 2005: 141（1）: 155-163.

　　8 Honig NM, Hume RI. Fluorescent carbocyanine dyes allow livingneurons of identified origin to be studied in long term cultures[J]. Cell Biol, 1986, 103（1）: 171-187.

　　9 Mandado M , Molist P, Anadón R. A DiItracing study of the neural connections of the pineal organ in two elasmobranchs （Scyliorhinus canicula and Raja montagui） suggests a pineal projection to the midbrain GnRHimmunoreactive nucleus[J]. Cell and Tissue Research, 2001, 303（3）: 391-401.

　　10Fernandez B, Bellido D, Vilella E, et al. Lipoprotein lipasemediated uptake of lipoprotein in human fibroblasts: evidence for an LDL receptorindependent internalization pathway[J]. Journal of Lipid Research, 1996, 37（3）: 464-481.

　　11Paul A. st. John. Toxicity of "DiI" for embryonic rat motoneurons and sensory meurons in vitro[J]. Life Sci, 1991, 49（26）: 2013-2021.

　　12Viterbo F, Trindade JC, Hoshino K, et al. Two endtoside neurorrhaphies and nerve graft with removal of the epineural sheath experimental study in rats[J]. Br J Plast Surg, 1994 , 47（2）: 75-80.

　　13Byers CT, Fan R, Messina A, et al. Comparing the efficacy of two fluorescent retrograde tracers in labeling the motor and sensory neuron populations of the rat sciatic nerve[J]. Journal of Neuroscience Methods, 2002, 114（1）: 159-164.

　　14Yang L, Zhang FX, Huang F, et al. Peripheral nerve injury induces transsynaptic modification of channels, receptors and signal pathways in rat dorsal spinal cord[J]. Eur J Neurosci, 2004, 19（6）: 871-883.

　　15Curtis R,Tonra JR, Stark JL. Neuronal injury increases retrograde axonal transport of the neurotrophins to spinal sensory neurons and motor neurons via multiple receptor mechanisms[J]. Mol Cell Neurosci, 1998, 12（1）: 105-118.

　　16Harsh C, Archibald SJ, Madison RD. Doublelabelling of saphenous nerve neurone pools: a model for determining the accuracy of axon regeneration at the single neuron level[J]. J Neurosci Methods, 1991, 39（1）: 123-129.

　　17Fritzsch B, Sonntag R. Sequential double labelling with different fluorescent dyes coupled to dextran amines as a tool to estimate the accuracy of tracer application and of regeneration[J]. J Neurosci Methods, 1991, 39（1）: 9-17.

　　18PalmG, Zdanov J, Gaitanaris AG, et al. The structural basis for spectral variations in green fluorescent protein[J]. Nature Struct Biol, 1997, 4（2）: 361-365.

　　19Heim R, Cubitt AB, Tsien RY. Improved green fluorescence[J]. Nature, 1995, 373（6516）: 663-672.

　　20Anna P, Alberto PG, Domingo RG, et al. Efficacy of the fluorescent dyes fast blue, fluorogold, and diamidino yellow for retrograde tracing to dorsal root ganglia after subcutaneous injection[J]. Journal of Neuroscience Methods, 1998, 86（1）: 7-16.

　　21Tsien RY.The green fluorescent protein[J]. Annu Rev Biochem, 1998, 67（2）: 509-544.

　　22常成, 高曉群. 病毒在神經(jīng)通路示蹤中的應(yīng)用[J]. 中國組織化學(xué)與細胞化學(xué)雜志, 2004, 13（2）: 250-254.

　　23Molliver DC, Wright DE, Leitner ML, et al. IB4binding DRG neurons switch from NGF to GDNF dependence in early postnatal life[J]. Neuron, 1997, 19（6）: 849-861.

　　24Cheryl L. Stucky and Gary RL. Isolectin B4positive andnegative nociceptors are functionally distinct[J]. The Journal of Neuroscience, 1999, 19（15）: 6497-6505.

　　25Belyantseva IA, Lewin GR. Stability and plasticity of primary afferent projections following nerve regeneration and central degeneration[J]. Eur J Neurosci, 1999, 11（2）: 457-469.