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moradec AH-101-AF說明書

更新時間:2021-02-24      點擊次數(shù):1387

moradec AH-101-AF說明書

aHFc-NC-MMAF

Anti-human IgG Fc-MMAF Antibody with Non-Cleavable Linker

Catalog Number AH-101-AF

Lot # 20200723-2

描述

HFc-NC-MMAF是抗人IgG Fc特異性抗體,通過不可裂解的連接子與一甲基auristatin F(MMAF)結(jié)合??贵w部分是人IgG Fc區(qū)的特異性多克隆抗體。單甲基澳瑞他汀F(MMAF)是一種細(xì)胞毒性小分子,通過阻斷微管蛋白的聚合來抑制細(xì)胞分裂。連接MMAF與抗體的不可裂解連接子在細(xì)胞外液中是穩(wěn)定的,但進(jìn)入細(xì)胞后可以通過非特定機(jī)制裂解。

 

申請方案

我們建議您對細(xì)胞進(jìn)行滴定,以確定基于細(xì)胞的活力檢測的數(shù)量。同樣重要的是確定2°ADC本身的濃度,而不會對每個細(xì)胞系造成顯著的細(xì)胞毒性(即小于10%的細(xì)胞死亡)。您可以選擇細(xì)胞毒性檢測的試驗方法。以下是使用CellTiter-Glo發(fā)光法作為檢測方法進(jìn)行細(xì)胞活力測定的兩個示例。

  • 在細(xì)胞活力試驗中使用恒定量的HFc-NC-MMAF:
    1. 在培養(yǎng)基中將細(xì)胞新鮮分裂成不透明的多孔板。在96孔板中每孔加入100μl細(xì)胞。典型范圍是96孔板中每孔約5000至20000個細(xì)胞。然而,應(yīng)確定每個細(xì)胞系的細(xì)胞數(shù)量。
    2. 在培養(yǎng)基中稀釋含單克隆一抗(mAb)的人Fc。然后在培養(yǎng)基中對一級mAb進(jìn)行系列稀釋。
    3. 在每個孔中加入2 l稀釋的一級mAb。一級mAb的終濃度應(yīng)介于100 nM-0.01 nM(或15 ng/μl-1.5 pg/μl)之間。在抗體存在下孵育細(xì)胞5-10 min。
    4. 同時,在培養(yǎng)基中制備2°ADC HFc-NC-MMAF稀釋液。應(yīng)確定每種細(xì)胞系中每種特定mAb的HFc-NC-MMAF稀釋度。然而,檢測孔中HFc-NC-MMAF的推薦初始濃度為6.6 nM(或1 ng/l)。例如,在這種情況下,將2.9 l11.3 M(或1.7 g/l)HFc-NC-MMAF稀釋于97.1 l培養(yǎng)基中,然后在用一級mAb預(yù)孵育的96孔板中每孔加入2 l稀釋的HFc-NC-MMAF。
    5. 此外,每個測定板中還應(yīng)包括未用一級mAb或2°ADC處理的對照孔,以獲得正常細(xì)胞生長值。
    6. 根據(jù)培養(yǎng)方案孵育多壁平板72小時。
    7. 向96孔板的每個孔中加入100 lCellTiter-Glo試劑。
    8. 在定軌振蕩器上混合內(nèi)容物2 min,以誘導(dǎo)細(xì)胞裂解。在室溫下孵育10 min。
    9. 讀取發(fā)光強(qiáng)度。

 

  • 在細(xì)胞活力試驗中應(yīng)用原代人IgG/HFc-NC-MMAF的恒定比率:
  1. 在培養(yǎng)基中將細(xì)胞新鮮分裂成不透明的多孔板。在96孔板中每孔加入100μl細(xì)胞。典型范圍是96孔板中每孔約5000至20000個細(xì)胞。然而,應(yīng)確定每個細(xì)胞系的細(xì)胞數(shù)量。
  2. 在培養(yǎng)基中稀釋含單克隆一抗(mAb)的人Fc。然后在培養(yǎng)基中對一級mAb進(jìn)行系列稀釋。
  3. 在每個孔中加入2 l稀釋的一級mAb。一級mAb的終濃度應(yīng)介于30 nM-0.01 nM(或4.5 ng/μl-1.5 pg/μl)之間。在抗體存在下孵育細(xì)胞5-10 min。
  4. 同時,在培養(yǎng)基中制備2°ADC HFc-NC-MMAF稀釋液。HFc-NC-MMAF應(yīng)在連續(xù)稀釋中制備,作為一級mAb。然后,在用mAb預(yù)孵育的96孔板中,每孔加入2 l稀釋的HFc-NC-MMAF。
  5. 每個測定板中應(yīng)包括未經(jīng)一級mAb或2°ADC處理的對照孔,以獲得正常細(xì)胞生長值。由于高濃度的2°ADC本身可對細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性,因此在不存在一級mAb的情況下獲得HFc-NC-MMAF的細(xì)胞毒性特征尤為重要。
  6. 根據(jù)培養(yǎng)方案孵育多壁平板72小時。
  7. 向96孔板的每個孔中加入100 lCellTiter-Glo試劑。
  8. 在定軌振蕩器上混合內(nèi)容物2 min,以誘導(dǎo)細(xì)胞裂解。在室溫下孵育10 min。
  9. 讀取發(fā)光強(qiáng)度。

 

示例數(shù)據(jù)

已經(jīng)證明,赫賽汀抗體-藥物偶聯(lián)物(T-DM1)對Her2過表達(dá)的腫瘤細(xì)胞(但不是Her2正常表達(dá)或Her2陰性細(xì)胞)具有強(qiáng)效殺傷活性1。在存在和不存在HFc-NC-MMAF的情況下,在表達(dá)不同量Her2標(biāo)記物的4種乳腺癌腫瘤細(xì)胞系中檢測了裸赫賽汀的細(xì)胞毒性。SKBR3和HCC1954為

 

Her2過表達(dá)細(xì)胞,MCF7具有正常的Her2表達(dá),MDA-MB468為Her2陰性。體外SKBR3對未偶聯(lián)赫賽汀處理輕微敏感,而HCC1954、MCF7和MDA-MB468對未偶聯(lián)赫賽汀1耐藥。未偶聯(lián)抗人IgG Fc抗體(HFc)未改變赫賽汀對這些細(xì)胞系的表觀效應(yīng)(圖A)。相反,在存在6.6 nM HFc-NC-MMAF的情況下,赫賽汀對Her2過表達(dá)的SKBR3和HCC1954細(xì)胞均表現(xiàn)出強(qiáng)效細(xì)胞毒性,而對MCF7或MDA-MB468細(xì)胞幾乎沒有殺傷作用(圖B)。同樣,在存在恒定比例(1:1)的HFc-NC-MMAF/赫賽汀的情況下,赫賽汀對Her2過表達(dá)的SKBR3和HCC1954細(xì)胞均顯示出強(qiáng)效細(xì)胞毒性(圖C)。2°ADC HFc-NC-MMAF單獨給藥對這些細(xì)胞的毒性極?。▓DD)。

儲存

以1.7 mg/mL PBS溶液的形式提供。儲存于-20 ℃或-70 ℃手動除霜冰柜中。避免反復(fù)凍融循環(huán)。

 

參考文獻(xiàn)

1. Lewis Phillips GD等人用抗體-細(xì)胞毒性藥物偶聯(lián)物曲妥珠單抗-DM1靶向Her2陽性乳腺癌。(2008),Cancer Res,68(22),第9280-90頁。

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